① 組織の摘出 |
① 組織の摘出 |
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② 浮遊細胞の調製 |
②-a. 脾細胞の場合 |
a. 脾細胞 |
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b. 胸腺細胞 |
②-b. 胸腺細胞の場合 |
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- 摘出した胸腺は、冷HBSSもしくはRPMI-1640中に保存します。
- HBSSを10~20mL入れたペトリディッシュに胸腺を取り出します。
- ハサミで組織を大まかに細切し、2枚のスライドグラスのフロスト部分を使ってすりつぶします。
- ピペットで細胞をコニカルチューブに集め、氷中に5分間静置します。
- ピペットを用いて、沈降した組織塊を入れない様に注意しながら浮遊液を別のコニカルチューブに移します。
- 300×g、5分間遠心分離を行い、上清をデカントまたは吸引除去します。
- HBSSを20mL加え、ピペッティングします。
- 300×g、5分間遠心分離を行い、上清をデカントまたは吸引除去します。
- HBSSを10mL加え、細胞懸濁液をナイロンメッシュに通します。
- 血球計算板等を用いて細胞数をカウントします。
- 残りの浮遊液を300×g、5分間遠心分離して、上清をデカントまたは吸引除去します。
- 細胞濃度が5~10×106/mLとなるようにHBSSを加えて、十分にピペッティングを行い、染色まで氷中に保存します(直ちに染色、測定しない場合は、2%FCSを加えてください)。
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c.リンパ節細胞 |
②-c. リンパ節細胞の場合 |
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- 摘出したリンパ節は、冷HBSSもしくはRPMI-1640中に保存します。
- HBSSを10~20mL入れたペトリディッシュにリンパ節を取り出します。
- ピンセットで脂肪組織を取り除き、2枚のスライドグラスのフロスト部分を使ってすりつぶします。
- ピペットで細胞をコニカルチューブに集め、氷中に5分間静置します。
- ピペットを用いて、沈降した組織塊を入れない様に注意しながら 、浮遊液を別のコニカルチューブに移します。
- 300×g、5分間遠心分離を行い、上清をデカントまたは吸引除去します。
- HBSSを20mL加え、ピペッティングします。
- 300×g、5分間遠心分離を行い、上清をデカントまたは吸引除去します。
- HBSSを10mL加え、細胞懸濁液をナイロンメッシュに通す。
- 血球計算板等を用いて細胞数をカウントします。
- 残りの浮遊液を300×g、5分間遠心分離して、上清をデカントまたは吸引除去します。
- 細胞濃度が5~10×106/mLとなるようにHBSSを加えて、十分にピペッティングを行い、染色まで氷中に保存します(直ちに染色、測定しない場合は、2%FCSを加えてください)。
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