研究のためのフローサイトメトリー

Ⅴ. 間接免疫蛍光法(ヒト細胞浮遊液およびヒト全血)

4. 2~10カラー解析( 精製抗体/ビオチン標識抗体/蛍光標識抗体)

サンプル処理 2~10カラー解析( 精製抗体/ビオチン標識抗体/蛍光標識抗体)

1. 準備 1. 準備
測定する患者検体ごとに試験管(12×75mm)を測定項目数+1本用意し、1本にコントロール、残りに抗体名をラベルします。
2. 抗体の添加 2. 抗体の添加*1
抗体名をラベルした試験管に各抗体を規定量*1加えます。コントロールの試験管には、調べたい抗体に対応するアイソタイプコントロールを加えます。
3. 検体の添加 3. 検体の添加
サンプル100μLを加え、よく攪拌します。
4. インキュベーション 4. インキュベーション
4℃で、暗所30~45分インキュベーションします。
5. 洗浄 5. 洗浄
PBSを2mL加え、 よく攪拌します。 400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。
6. 2次抗体の添加 6. 2次抗体の添加
再浮遊後、2次抗体のFITCまたはPE標識ヤギ抗マウスIgG(H+L)F(ab')2を加えます。 または、1次抗体の動物種およびアイソタイプにマッチした2次抗体を加えます。
7. インキュベーション 7. インキュベーション
4℃で、暗所30~45分インキュベーションします。
8. 洗浄 8. 洗浄
PBSを2mL加え、 よく攪拌します。400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。
もう1回、 繰り返します。
9. 2次抗体のブロッキング 9. 2次抗体のブロッキング
マウスイムノグロブリン1mg/mLまたは、1次抗体と同じ動物種の正常血清を100μL加え、室温15分反応させます。
10. ビオチン標識抗体・FITCまたはPE、PC5標識抗体の添加 10. ビオチン標識抗体・FITCまたはPE、PC5標識抗体の添加*1
抗体名の試験管にビオチン標識抗体、 FITC、PE、PC5標識抗体を規定量*1加えます。
11. インキュベーション 11. インキュベーション
4℃で、暗所30~45分インキュベーションします。
12. 洗浄 12. 洗浄
PBSを2mL加え、し、上清を除去します。
もう1回、繰り返します。
13. 蛍光標識アビジンの添加 13. 蛍光標識アビジンの添加
ビオチン標識抗体を用いた場合は、抗体名の試験管に至適濃度に調整した蛍光標識ストレプトアビジンを加えます。
FITC、PE、PC5標識抗体のみを用いた場合は、15.へ進んでください。
14. インキュベーション 14. インキュベーション
4℃で、暗所30~45分インキュベーションします。
細胞浮遊液の場合は、終了後17.へ進んでください。
15. 洗浄 15. 洗浄
PBSを2mL加え、 よく攪拌します。 400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。
16. 溶血処理(ヒト全血のみ) 16. 溶血処理(ヒト全血のみ)
ヒト全血検体の場合は、溶血操作を行います。
溶血試薬の種類により、目次の直接免疫蛍光法 (ヒト全血) を から該当する溶血剤を選び手順をご参照ください。
17. 洗浄 17. 洗浄
PBSを2mL加え、 Vortexでよく攪拌します。
400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。
もう1回繰り返します。
18. 測定 18. 測定
PBS 500μLに再浮遊後、測定まで2~8℃で遮光保存し、なるべく速やかにフローサイトメーターで測定してください。
すぐに測定できない場合は、0.5%パラホルムアルデヒドPBS 500μL に再浮遊し、24時間以内に測定してください。
  • 1テストあたりの抗体規定量
    COULTER CLONE:使用前に5μLに血清加 PBS195μLの割合で希釈し、200μLご使用ください。
    IOTest:20μLまたは10μL