研究のためのフローサイトメトリー

Ⅴ. 間接免疫蛍光法（ヒト細胞浮遊液およびヒト全血）

1．細胞浮遊液の調製

  「Ⅱ. 試薬・材料および検体③単核細胞分離サンプル（比重遠心法）」に従って、サンプル処理を行ってください。末梢血を分離したサンプル中に赤血球が少量残っている場合は、塩化アンモニウム溶血剤で赤血球を溶血しておいてください。
ヒト全血サンプルで分析する場合は「Ⅱ.試薬・材料および検体」の①全血( 2．検体 )を参照してください。
リンパ節からの浮遊液調整については、「Ⅱ. 試薬・材料および検体」の④リンパ節浮遊液( 2．検体)を参照してください。
 
単核細胞分離サンプル
（比重遠心法）		 【調製法】
リンパ球分離液を用いて、ヒト全血やヒト骨髄サンプルより単核細胞を分取し、1×107個／mLに調整します。
  • 15mL遠沈管にヒト全血（凝固剤含む）を4mLとり、ほぼ等量のPBSを加え、転倒混和します。
  • 別の遠沈管にリンパ球分離液を4mL入れ、その上に1.の希釈血液を重層します。
  • 4℃＊で、400×g、30分間遠心します。
  • 分離液と血漿の間の層をピペットでとり、別の試験管に移します。
  • PBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、8分間遠心します。
  • 上清を吸引除去し、沈渣にPBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、4分間遠心します。
  • 吸引除去し、沈渣にPBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、3分間遠心します。
  • 吸引除去し、沈渣にPBSを加え、細胞濃度を1×104／mm3（1×107／mL）に調整します。
  • Fcレセプタによる非特異染色が予想させる場合は、抗体反応の10～15分前にヒトγグロブリンを最終濃度1mg／mLになるよう加えます。表面イムノグロブリンを染色する場合は、ヒトγグロブリンは入れないでください。
＊:リンパ球分離液により遠心時の温度設定が異なります。リンパ球分離液の添付書をご参照ください。

 
末梢血を分離したサンプル中に赤血球が少量残っている場合は、塩化アンモニア溶血剤で溶血します。
 
塩化アンモニウム溶血剤
【調製法】
  • NH4Cl
  • 8.26g／L
  • KHCO3
  • 1.0g／L
  • EDTA-4Na
  • 0.037g／L

 これらを蒸留水1Lに溶解します｡
IOTest 3 溶血試薬（製品番号IM3514）が使用可能です。