研究のためのフローサイトメトリー

Ⅳ. 直接免疫蛍光法(ヒト細胞浮遊液)

1.細胞浮遊液の調製

  「Ⅱ. 試薬・材料および検体③単核細胞分離サンプル(比重遠心法)」に従って、サンプル処理を行ってください。ヒト末梢血を分離したサンプル中に赤血球が少量残っている場合は、塩化アンモニウム溶血剤で赤血球を溶血しておいてください。
リンパ節からの浮遊液調整については、「Ⅱ. 試薬・材料および検体」の (4)リンパ節浮遊液 ( 2.検体)を参照してください。
 
単核細胞分離サンプル
(比重遠心法)
リンパ球分離液(Ficoll-paque:Pharmacia社等)を用いて、ヒト全血やヒト骨髄サンプルより単核細胞を分取し、1×107個/mLに調整します。
【調製法】
  • 15mL遠沈管に全血(凝固剤含む)を4mLとり、ほぼ等量のPBSを加え、転倒混和します。
  • 別の遠沈管にリンパ球分離液を4mL入れ、その上に1.の希釈血液を重層します。
  • 4℃で、400×g、30分間遠心します。
  • 分離液と血漿の間の層をピペットでとり、別の試験管に移します。
  • PBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、8分間遠心します。
  • 上清を吸引除去し、沈渣にPBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、4分間遠心します。
  • 吸引除去し、沈渣にPBSを加え、よく撹拌し、4℃で、400×g、3分間遠心します。
  • 吸引除去し、沈渣にPBSを加え、細胞濃度を1×104/mm3(1×10 7 /mL)に調整します。
  • Fcレセプタによる非特異染色が予想させる場合は、抗体反応の10~15分前に、ヒトγグロブリンを最終濃度1mg/mLになるよう加えます。表面イムノグロブリンを染色する場合は、ヒトγグロブリンは入れないでください。
*:リンパ球分離液により遠心時の温度設定が異なります。 リンパ球分離液の添付説明書をご参照ください。

 
末梢血を分離したサンプル中に赤血球が少量残っている場合は、塩化アンモニア溶血剤で溶血します。
 
塩化アンモニウム溶血剤
【調製法】
  • NH4Cl
  • 8.26g/L
  • KHCO3
  • 1.0g/L
  • EDTA-4Na
  • 0.037g/L

これらを蒸留水1Lに溶解します。
IOTest 3 溶血試薬(製品番号IM3514)が使用可能です。