研究のためのフローサイトメトリー

Ⅲ. 直接免疫蛍光法 (ヒト全血)

2.Wash

(6)IOTest 3 溶血試薬(塩化アンモニウム溶血試薬)(Wash)

サンプル処理 1~10カラー解析(FITC/PE/ECD/PC5/PC7/APC/APC A700/APC A750/PB/KO)

1. 準備 1. 準備
測定する患者検体ごとに試験管(12×75mm)を測定項目数+1本用意し、1本にコントロール、残りに抗体名をラベルします。
2.抗体の添加 2.抗体の添加*1
抗体名をラベルした試験管に各抗体を規定量*1加えます。コントロールの試験管には、調べたい抗体に対応するアイソタイプコントロールを加えます。
3. 検体の添加 3. 検体の添加*2
全血100μL*2を加え、よく攪拌します。
4. インキュベーション 4. インキュベーション
室温(20~25℃)、暗所で15~30分インキュベーションします。
5. 溶血の添加 5. 溶血の添加
あらかじめ蒸留水で10倍希釈したIOTest 3 溶血試薬2mLを加え、よく攪拌します。
6. インキュベーション 6. インキュベーション
室温(20~25℃)、暗所で10分インキュベーションします。
(2時間までインキュベーション可能です。)
9. 洗浄 7. 洗浄
PBSを2mL加え、 よく攪拌します。
400~450×g、5分間遠心し、上清を除去します。
※ 遠心・洗浄のポイント!
10. 測定 8. 測定
PBS 500μLに再浮遊後、測定まで2~8℃で遮光保存し、なるべく速やかにフローサイトメーターで測定してください。すぐに測定できない場合や固定が必要な場合は、PBSで10~20倍希釈したIOTest 3固定試薬または0.5%パラホルムアルデヒドPBS 500μLに再浮遊し、24時間以内に測定してください。
    • 1テストあたりの抗体規定量
      COULTER CLONE:使用前に5μLに血清加 PBS195μLの割合で希釈し、200μLご使用ください。
      CYTO-STAT:10μL
      OptiClone:20μL
      IOTest:20μLまたは10μL
    • 白血球数が3~10×103/mm3である検体を用いてください。
      検体の白血球数の調整は、『Ⅱ.試薬・材料および検体』の①ヒト全血の項( 2.検体 )をご参照ください。