研究のためのフローサイトメトリー

Ⅲ. 直接免疫蛍光法 （ヒト全血）

2．Wash

（5）VersaLyse 溶血試薬（Wash）

サンプル処理　1～10カラー解析（FITC／PE／ECD／PC5／PC7／APC／APC A700／APC A750／PB／KO）

1. 準備 1. 準備
測定する患者検体ごとに試験管（12×75mm）を測定項目数＋1本用意し､1本にコントロール､残りに抗体名をラベルします｡
2.抗体の添加 2.抗体の添加＊1
抗体名をラベルした試験管に各抗体を規定量＊1加えます｡コントロールの試験管には､調べたい抗体に対応するアイソタイプコントロールを加えます｡
3. 検体の添加 3. 検体の添加＊2
全血100μL＊2を加え､よく攪拌します｡
4. インキュベーション 4. インキュベーション
室温（20～25℃）､暗所で15～30分インキュベーションします｡
5. 溶血の添加 5. 溶血剤の添加
VersaLyse 溶血試薬を1mL加え、よく攪拌します。
細胞の固定を行う場合は、あらかじめVersaLyse 溶血試薬にIOTest 3 固定試薬を添加した、溶血固定液を調整しておきます。（VersaLyse 溶血試薬：IOTest 3 固定試薬＝1mL：25μL）
6. インキュベーション 6. インキュベーション
室温（20～25℃）､暗所で10分インキュベーションします｡
（2時間までインキュベーション可能です｡）
9. 洗浄 7. 洗浄
PBSを2mL加え､ よく攪拌します｡
400～450×g､5分間遠心し､上清を除去します｡
※ 遠心・洗浄のポイント！
10. 測定 8. 測定
PBS 500μLに再浮遊後、測定まで2～8℃で遮光保存し、なるべく速やかにフローサイトメーターで測定してください。すぐに測定できない場合は、PBSで10～20倍希釈したIOTest 3固定試薬または0.5％パラホルムアルデヒドPBS 500μLに再浮遊し、24時間以内に測定してください。
    • 1テストあたりの抗体規定量
      COULTER CLONE:使用前に5μLに血清加 PBS195μLの割合で希釈し､200μLご使用ください｡
      CYTO-STAT:10μL
      OptiClone:20μL
      IOTest:20μLまたは10μL
      ＊必要に応じて、抗体使用濃度検討を行う場合は、規定量をもとにガイドライン（Cytometry B Clin Cytom. 2013 Sep-Oct;84(5):291-308）に従ってください。
    • 白血球数が3～10×103／mm3である検体を用いてください｡
      検体の白血球数の調整は､『Ⅱ.試薬･材料および検体』の①ヒト全血の項( 2．検体 )をご参照ください｡