研究のためのフローサイトメトリー

Ⅱ. 試薬・材料および検体

1. 試薬・材料

①PBS(リン酸緩衝液) ①細胞洗浄、細胞再浮遊に用います。
a.0.1%アジ化ナトリウム加PBS
(Ca2+、M2+不含)
①-a.アジ化ナトリウム(NaN3)不含PBS:市販Dulbecco's PBS(-)使用可
【調製法】
  • NaCl
  • 8.0g
  • KCl
  • 0.2g
  • Na2HPO4
  • 1.15g
  • KH2PO4
  • 0.2g
  • NaN3
  • 1g

これらを蒸留水1Lに溶解します。
b.血清加PBS ①-b.ヒト骨髄サンプルの希釈に用います(溶血処理にイムノプレップ&TQ-Prepを使用する場合は、②をご参照ください)
【調製法】
①-a に2%NBS(新生子ウシ血清)または0.1%BSA(ウシ血清アルブミン)を加えます。
c.細胞固定液
0.5%パラホルムアルデヒド加PBS溶液
または0.4~0.8%ホルムアルデヒド加
PBS溶液
①-c【調製法】

1. 5%パラホルムアルデヒド 加PBSストック溶液

  • 1)5gパラホルムアルデヒドを1N NaOH 10mLに溶解します。
  • 2)PBSを加えて80mLにします。
  • 3)4N HClでpH7.2±0.1になるように調整します。
  • 4)PBSを加えて100mLにします。
  • 2.
  • 上記1.のストック溶液を、適宜PBSにて10倍希釈したものをワーキングソリューションとして 用います。
    →0.5%パラホルムアルデヒド加PBS溶液

IOTest 3 固定試薬(8%ホルムアルデヒド,製品番号A07800)は、使用時にPBSで10~20倍 希釈(0.4~0.8%ホルムアルデヒド加PBS溶液)してご使用ください。

②自己血漿または正常ヒトAB型血漿 TQ-Prepで溶血するヒト全血検体の細胞濃度を調整する場合に用います。
③マウスIgG
  またはヒトΓグロブリン
③非特異反応の起こりやすいサンプルの場合にブロッキング試薬として用います。
④リンパ球分離液
(Ficoll-paque:Pharmacia社等)
④単核球を分離する場合に用います。
Ⅱ試薬・材料および検体の2.検体 ③単核球分離サンプルを参照してください。
⑤溶血試薬 ⑤用途に合わせてお選びください。
a. イムノプレップ
(製品番号7546999)
⑤-a. 自動サンプル調製システム ベックマン・コールター社TQ-Prep用溶血試薬
調整の必要はありません。
b.OptiLyse B
(製品番号IM1400)
⑤-b. B.D社フローサイトメーター用溶血試薬
調整の必要はありません。
c. OptiLyse C
(製品番号A11895)
⑤-c. ベックマン・コールター社フローサイトメーター用溶血試薬
調整の必要はありません。
d. 全血ライジング・キット
(製品番号6603152)
⑤-d. FCMの機種に依存せず、専用の機器も必要としない溶血試薬です。
【調製法】
イムノライズを使用時にPBSで25倍希釈します(1検体当たり希釈液1mLを使用します)。
e. VersaLyse 溶血試薬
(製品番号A09777)
⑤-e. FCMの機種に依存せず、専用の機器も必要としない溶血試薬です。
溶血処理のみ行う場合、試薬調整の必要はありません。
溶血及び固定を同時に行う場合は、あらかじめ溶血固定液を調整しておく必要があります。
【溶血固定液の調整法】
VersaLyse 溶血試薬IOTest 3 固定試薬=1mL:25μLの割合で混合します。
溶血固定には、この混合液を1検体あたり1mL使用します。
f. IOTest 3 溶血試薬
(10倍濃縮塩化アンモニウム
  溶液)
(製品番号A07799)
⑤-f. FCMの機種に依存せず、専用の機器も必要としない溶血試薬です。
【調整法】
使用時に蒸留水で10倍希釈します。
⑥蒸留水 ⑥凍結乾燥製品の溶解およびOptiLyse Bによる溶血処理の際に用います。
⑦12×75mmサンプルチューブ ⑦製品番号6199306または6199307またはA26428
⑧遠心機  
⑨Voltexミキサー  
⑩アスピレータ  
⑪マイクロピペッタおよびチップ ⑪20μL以下用、20~200μL用、100~1000μL用
⑫アイスバス  
⑬15mL遠沈管