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植物細胞を用いたDNA量測定例

フローサイトメーター(FCM)を用いることで、植物細胞のDNA量測定を簡単に行うことができます。Quanta SC MPLを使った測定例をご紹介いたします。

サンプル調製：倍数性推定

  1. 植物体*1の葉身（2cm2程度）をペトリ皿上に切り取り、1mL PVP溶液（核解離溶液：50 mM Tris-HCl, 0.5% polyvinylpyrrolidone-K90, 0.01% Triton-X, 0.63% sodium sulfate, pH7.5）を加え、数分放置する。
    ＊1.ゲノムサイズを推定する際は、必ず内部標準となる植物体を併用する。
    ＊1.Brachiaria属におけるゲノムサイズ推定ではイネ品種日本晴（Oryza sativa）を内部標準として用いている。
  2. カミソリ（FEATHER Ltdなど）で葉を細片する。（100～150回程度）
  3. サンプル液はナイロンメッシュ（30μm）を通し、1.5 mLエッペンドルフチューブなどに移し濾過する。
  4. サンプル液を遠心する。（6,000rpm、1～2分間）
  5. 上清を捨て、500μL PVP溶液を加え、ボルテックスを行う。
  6. 50～100μLのPI溶液（1mg/mL）を、サンプル液に加え混和する。
  7. 5分間放置し染色する。
  8. フローサイトメーター（Quanta SC MPL）を用いて測定する。

補足①
植物種によっては、手順4および5を省略した方が良い場合がある。
まず初めに、手順4と5を省略した方法でサンプル液を調製および測定し、確認してみると良い。

補足②
ゲノムサイズ推定の際には、手順6の50～100μL のPI溶液に0.25～0.5μLのRNase（10mg/mL）を添加し、30分間室温で放置し、RNAを消化する。

サンプルデータ例

  1. マメ科モデル植物ミヤコグサの実験系統における蛍光ピーク
    マメ科モデル植物ミヤコグサの実験系統における蛍光ピーク
  2. イネ科牧草ルジグラスの倍数性ピーク
    ２倍体ルジグラスと４倍体ルジグラスの同時測定蛍光ピーク
    (４倍体ルジグラスは２倍体ルジグラスへのコルヒチン処理により作出しました。)
    イネ科牧草ルジグラスの倍数性ピーク
  3. イネ科牧草ブラキアリア属に属する草種の様々な倍数性ピーク
    イネ科牧草ブラキアリア属に属する草種の様々な倍数性ピーク
    イネ科牧草ブラキアリア属に属する草種の様々な倍数性ピーク

References

  1. Ishigaki, et al., (2009). Induction of tetraploid ruzigrass (Brachiaria ruziziensis)　plants by colchicine treatment of in vitro multiple-shoot clumps and seedlings. Grassland Science. 55: 164-170.
  2. Ishigaki, et al., (2010). Estimation of genome size in Brachiaria species. Grassland Science. 56: 240-242.
  3. Kawasaki, et al., (2000). Genome Analysis of Lotus japonicus. Journal of Plant Research. 113: 497-506.

データ提供：宮崎大学　フロンティア科学実験総合センター
遺伝資源分野　明石研究グループ様

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