アプリケーショントピックス 37種類

FCMを用いたヒト精子の機能解析

精子のFCM解析でメジャーな手法としては、Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA)があります。SCSAはヒト精子を酸処理して、アクリジンオレンジ染色を行い、二本鎖DNAの塩基対に挿入されたアクリジンオレンジは緑に、クロマチン構造が壊れ一本鎖のDNAは赤に染色される特性を利用して精子核の損傷度を測定する手法です。
また、より特異的にDNA断片化の検出が行えるTUNELを用いて同検体での相関(r=0.8296)をとり、簡便なアッセイであるSCSAの信頼度を得ています。

Memo

不妊治療専門施設ではレシピエント(患者)の貴重な配偶子を用いる性質上、効率よく受精、移植、着床、妊娠につなげるための事前検査は治療を左右する重要な役割を担い、検査結果を中心に個別にカスタマイズされた治療を行なっています。卵子に比べ精子は数を確保しやすい傾向にありますが、その集団の中で受精、胚発生、妊娠の結果が得られる、または得られない精子がどのくらい含まれるかという質の問題が重要視されています。
通常の専門施設では精液所見(精液量・精子濃度・精子運動率・正常形態精子率・白血球濃度)等を調べますが、検査時間の制限から、顕微鏡観察を用いてわずかな数の精子しか検査できません。FCMでは一万以上の精子をわずか2、3分で調べられるため、近年その利点を用いたヒト精子の解析が世界的に増加しています。
男性不妊の患者では精子クロマチンの変性により精子核が十分折りたたまれず、DNAが損傷しやすいといわれています。DFI(DNA fragmentation index)が30%以上の場合、体外受精では人工授精に比べて妊娠率が高いことが報告されています。またHDS(High DNA stainability)は精子形態形成時の成熟過程で精子核が十分に凝縮されなかった未熟な精子の割合です。
HDSが 10% 以上の場合、体外受精の方では人工授精に比べて妊娠率が高いことが報告されています。

SCSA

  1. 凍結保存精液を融解し、TNE buffer(pH 7.4)*に懸濁
  2. 酸処理(pH 1.2,30秒)
  3. 中和緩衝液と6μg/ml acridine orange solutionを添加して迅速にFCMで測定 (Fig. A)
    *TNE buffer pH 7.4 in DW
      0.01M Tris-HCl, 0.015M NaCl, 1mM EDTA disodium

TUNEL

  1. 2%PFAで固定した精子に膜浸透化処理を行ないlabel solution と terminal deoxynucleotidyl transferase(In Situ Cell Death Detection Kit, fluorescein, Roche )を添加して37度、1時間酵素反応を行う
  2. 2回のPBS洗浄後Propidium Iodide(PI)を加えてFCMで測定 (Fig. B)


ヒト精子SCSAとTUNELのFCM解析 (同一検体を用いてのSCSAとTUNELの一例)

(A)SCSA, blue: normal sperm, red (DFI): denatured sperm, green (HDS): immature sperm, gray: debris
(B)TUNEL, FITC+: DNA fragmentation sperm


References

  1. Utility of the sperm chromatin structure assay as a diagnostic and prognostic tool in the human fertility clinic. Evenson DP,et al. Hum Reprod. 1999 Apr; 14(4):1039-49.
  2. The predictive value of sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters for the outcome of intrauterine insemination, IVF and ICSI. Bungum M, et al. Hum Reprod. 2004 Jun; 19(6):1401-8. Epub 2004 Apr 29.
  3. Sperm chromatin structure assay (SCSA) parameters are related to fertilization, blastocyst development, and ongoing pregnancy in in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles. Virro MR, et al. Fertil Steril. 2004 May; 81(5):1289-95.

データ提供:木場公園クリニック様

一覧へ戻る