フローサイトメトリー入門
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FCMを用いた血清中の抗HLA抗体Panel Reactive Antibodies（PRA）解析例
精製HLA 抗原をコーティングした直径2～4μｍのマイクロビーズに結合する抗HLA抗体を、FITC標識抗ヒトIgG Fcγで蛍光標識して、フローサイトメーター Cytomics FC500で測定しました。血清中の抗HLA Class ⅠまたはClass Ⅱ抗体の存在の有無の確認、及び％PRAの測定用キットFlowPRA™（株式会社ベリタス http://www.veritastk.co.jp/）を用いて測定した例です。
Memo
HLA抗体は、臓器移植、造血幹細胞移植、血小板輸血不応答、輸血副作用（TRALI）などに関連して測定されています。従来はLCT法（リンパ球細胞毒性試験）あるいはAHG-LCT法（補体非依存性のHLA抗体も検出できる方法）が行われてきましたが、いずれも新鮮ヒトリンパ球を用いるためパネルの確保や細胞のViabilityの維持が難しく、操作も煩雑であるといった課題がありました。
マイクロビーズを用いFCM法を測定原理としたことで、FlowPRA™は、簡便な操作で高感度かつ同一LOTでの検体処理が可能です。
FlowPRA™ Screening Testの測定手順
30種類の異なるパネル抗原を結合したHLA Class Ⅰビーズ、同じく30種類の異なるパネル抗原を結合したHLA Class Ⅱビーズ、および非特異的反応確認用のコントロールビーズの3種類（すべて580nm付近の蛍光を持つビーズ）を混和したものに、被検血清を反応させた後、2次抗体FITC標識抗ヒトIgG Fcγで染色し、HLA抗原と反応した血清中のIgGをFITC蛍光強度で検出します。
Class Ⅰビーズ（赤色表示）、ClassⅡビーズ（青色表示）、コントロールビーズ（水色表示）は、ほぼ同じ大きさを持ち、580nm付近の赤色の蛍光波長で、それぞれ異なった蛍光強度を持っています。前方散乱光と赤色蛍光で2パラメーターヒストグラムを作成し、各ビーズの集団にゲートを設定し、それぞれのゲート内のFITC蛍光（緑色蛍光）の陽性率を測定します（FlowPRAわずかな蛍光強度の変化を測定する必要があります。そのため、ネガティブコントロール用のビーズのピーク位置を100～101の間に設定するようにしてください）。
ClassⅠ陽性コントロール血清を測定したデータ
ClassⅠビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅠネガティブコントロール
- 実線赤色：
- ClassⅠ陽性コントロール血清
（ClassⅠ陽性率99.4％）
Controlビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅠネガティブコントロール
- 実線水色：
- ClassⅠ陽性コントロール血清
Controlビーズの位置が動かないことを確認します。
ClassⅡ陽性コントロール血清を測定したデータ
ClassⅡビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅡネガティブコントロール
- 実線青色：
- ClassⅡ陽性コントロール血清
（ClassⅡ陽性率99.5％）
Controlビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅡネガティブコントロール
- 実線水色：
- ClassⅡ陽性コントロール血清
Controlビーズの位置が動かないことを確認します。
検体測定データ例1
ClassⅠビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅠネガティブコントロール
- 実線赤色：
- ClassⅠ検体1血清（陽性率71.8％）
ClassⅡビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅡネガティブコントロール
- 実線青色：
- ClassⅡ検体1血清（陽性率 4.1％）
Controlビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ネガティブコントロール
- 実線水色：
- 検体1血清
Controlビーズの位置が動かないことを確認します。
検体測定データ例2
ClassⅠビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅠネガティブコントロール
- 実線赤色：
- ClassⅠ検体2血清
（陽性率80.9％％）
ClassⅡビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ClassⅡネガティブ
コントロール - 実線青色：
- ClassⅡ検体2血清
（陽性率 26.8％）
Controlビーズにゲート
- 点線白抜き：
- ネガティブコントロール
- 実線水色：
- 検体2血清
Controlビーズの位置が動かないことを確認します。
