サイトメトリーとは

3. 像から流れの中のパルスへ

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コールター原理

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Coulter Counter Model A
Coulter Counter Model A

Cytomics FC500
フローサイトメーター

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Wallace H.Coulterは、自宅裏の地下室に篭って新しい微粒子計測法を研究し、1947年に、後に「コールター原理」と呼ばれる3次元的粒子体積測定法を考案します。

Coulterは6年後に特許を取得して起業し、Coulter Counter Model Aを製造しました。
この画期的なツールは、顕微鏡と血球算定板を用いて目視で計数していた細胞数測定を自動化したものであり、細胞容積のパラメータ(Coulter Volume)で正確な粒度分布解析も可能でした。

個々の細胞を「像」としてとらえる概念から離れて、流れの中で1個の電気パルスとして細胞をとらえるという、今日のフローサイトメトリーの基礎となる独創的な概念に基づいた、高速かつ高精度で客観的な細胞定量法の始まりです。

さらに、1965年にMarck FulwylerがCoulter Counterを改造し、 ジェットノズルと液滴荷電を用いたソーティング法を開発しました。 1969年にはVan Dillaがアルゴンレーザーを搭載した直交型光学系を 持つフローサイトメーターを開発し、初めて細胞周期を定量解析しました。

当初は、Coulter Volumeと蛍光を測定し、その2次元ヒストグラ ムから目的の細胞の割合を求め、細胞を分取していましたが、後に前方 散乱光に側方散乱光を加えて 細胞形態情報を増やし、蛍光 も1カラーから2本のレーザーを用いた2カラー測定になりました。

モノクローナル抗体の発明以降は、多重染色のニーズに拍車がかりますが、 科学の進歩はここでも課題を次々に克服していき、フローサイトメーターはより簡便により多くのパラメータを測定できるように改良されていきます。クオーツフローセル の導入、マイクロプレートソーティング、2カラー蛍光補正回路、フィコビルタンパク蛍光色素とそのタンデム化による多重染色用蛍光色素の開発、デジタル制御による操作性の向上、小型空冷レーザー、逆行列解析による自動蛍光補正、小型半導体レーザーによる装置の小型化、デジタルシグナルプロセッサによる高速パルス処理など様々な技術革新を経て現在に至っています。

参考:FCMの原理入門講座

顕微鏡 FCM
スピード ×
再現性 ×
個人誤差 主観 客観
蛍光定量性 ×
マルチカラー ×
形態情報 ×