サイトメトリー最新技術紹介

デジタルフローサイトメーター新技術 弱点の克服

現状の不満点・問題点

従来のアナログ方式のフローサイトメーターは、3カラー以上の蛍光補正が困難で、不正確な設定になってしまいます。
また、ノイズが多く、さらに対数データの直線性が低く、正確なネガティブピークを描くことができません。

アナログ方式(図1. 上)は、シグナルパルスの処理をすべて完了した後、最後にA/Dコンバーター(アナログデジタル変換器)で数値化し、コンピュータに送ります。一方、デジタル方式(図1. 下)は、プリアンプでシグナルパルスの調整をした後、すぐに数値化し、その高分解能なリニアデータを用いて、DSP(デジタルシグナルプロセッサー)で蛍光補正とLog(対数)変換などを、算術的に処理します。

図1. アナログ方式とデジタル方式 概念図
図1.アナログ方式とデジタル方式 概念図

デジタル方式のメリットは、高分解能なリニアデータを用いて、高精度な対数データが取得でき、またフルマトリックス蛍光補正が行える点です。

デジタル方式は、さらに2つに分かれます。
(1) ピークホールド型(ハイブリッド型)
(2) 時間サンプリング型(フルデジタル型)

時間サンプリング型は、新しい技術で、秒1万個以上の高速測定に対応できます。回路設計を巧妙に行えば、
1秒間に5万個以上の超高速測定や超高速ソーティングが実現でき、さらにS/N比の向上も可能です。

デジタル方式には、広い測定範囲をカバーする高分解能のA/Dコンバーターが必須です。抗体を用いる免疫蛍光測定では、強陽性と陰性の蛍光の強度範囲が広く、通常は1:10,000の4桁の範囲の対数データで表示します(図2)。

図2. フローサイトメトリーの測定範囲
図2. フローサイトメトリーの測定範囲

最大1万倍の差がある各シグナルパルスの高さ(面積)を、デジタル方式は直接、数値化し、その高分解能なリニアデータを基にLog(対数)変換する必要があります。従来の14ビットデジタル方式は、元になるリニアデータの分解能が低いため、対数データの目盛の小さな値の範囲(一桁目)での量子化誤差が大きな問題でした(図3)。

図3. 14ビットデジタル方式の量子化誤差

図3. 14ビットデジタル方式の量子化誤差

そのため、陰性ピークの位置が高い位置(10から100の間)に出るように感度調整をしなければならず、強陽性のピークが10,000を越えてスケールアウトすることがありました。実質的には、3桁の対数データでした(図4)。

図4. 14ビットデジタル方式の陰性ピーク位置

図4. 14ビットデジタル方式の陰性ピーク位置

デジタル方式のA/Dコンバーターの分解能(ビット数)と対数(1から10,000)の測定分解能の関係を下表に示します(ピークパルスの場合)。

表1. デジタル方式のビット数と対数の分解能

対数目盛 1   10   100   1000   10000
1桁の分解能   分解能   分解能   分解能   分解能  
14ビットADC 2 14 16 148 164 1,474 1,638 14,746 16,384
16ビットADC 7 59 66 589 655 5,899 6,554 58,982 65,536
18ビットADC 26 236 262 2,359 2,621 23,593 26,214 235,930 262,144
20ビットADC 105 944 1,049 9,437 10,486 94,372 104,858 943,718 1,048,576
22ビットADC 419 3,775 4,194 37,749 41,943 377,487 419,430 3,774,874 4,194,304
23ビットADC 829 7,460 8,289 74,597 82,886 745,975 828,861 7,459,747 8,288,608

アナログ方式の場合、アナログ回路でシグナルパルスをログ変換した後、10ビットA/Dコンバーター、すなわち1024チャンネル(レベル)で数値化します。つまり、対数1桁の範囲の測定分解能は、256チャンネル(レベル)です。
デジタル方式の場合、14ビットA/Dコンバーターならば、対数一桁目の測定分解能はわずか14チャンネル(レベル)しかありません(表1)。これでは、正確な陰性ピークを描くことができません(図3参照)。これは14ビットデジタルフローサイトメーターの弱点で、推量補間とスムージング、積分処理(時間サンプリング型)などで、陰性ピークを取り繕うことがあります。そのため、高感度のフローサイトメーターとヒストグラムデータが異なることがあります。下図のように感度・分解能に影響をおよぼします。

デジタル方式フローサイトメーター 分解能・感度の比較データ
デジタル方式フローサイトメーター 分解能・感度の比較データ

アナログ方式と同等以上(256チャンネル以上)の測定分解能を得るためには、19ビット以上のA/Dコンバーターが必要です。しかしながら、現在、時間サンプリング型デジタル方式に使用可能なA/Dコンバーターは、最高16ビットです。


Dual ADC技術

Dual ADC技術(弊社特許)を用いれば、20ビット以上の高分解能リニアデータを手に入れることができます。シグナルを2つに分け、増幅率の異なる2つのプリアンプを用いて、2つのA/Dコンバーターで同時に数値化します。2つの数値データを比較して、数学的に1つに合体させ、20ビット以上の高分解能リニアデータにします(図5)。
この独創的な技術により、正確な陰性ピークが得られます。また、20ビット以上あるので、高精度自動蛍光補正が行えます。Dual ADC技術はデジタルNRの効果も大幅に向上させ、蛍光感度や散乱光感度が向上します。さらに、22ビット以上あれば、1:100,000の5桁の対数範囲をカバーすることも可能です(図6)。アナログ方式では、5桁の対数データは不可能です。

図5. Dual ADC 23 概念図(23ビット)

図5. Dual ADC 23 概念図(23ビット)

図6. 5桁の対数データ
図6. 5桁の対数データ

Dual ADC技術のメリット

  1. 正確な陰性ピークが得られます。
  2. 高精度自動蛍光補正が行えます。
  3. 蛍光感度や散乱光感度が向上します。
  4. 1:100,000の5桁の対数データが得られます。(22ビット以上)
  5. 測定表示範囲の変更(ズーム機能)が測定後に行なえます。

Dual ADC技術は、弊社デジタルフローサイトメーターCytomics FC500には20ビットハイブリッドタイプ、Galliosには20ビットフルデジタルタイプ、セルソーター MoFlo XDPセルソーター MoFlo Astriosには23ビットフルデジタルタイプが搭載されています。


参考データ

デジタル方式フローサイトメーター
機種名 形式 サンプリング周波数 デジタル変換分解能
MoFlo Astrios EQ フルデジタル型 100Mz 23ビット
MoFlo XDP フルデジタル型 100Mz 23ビット
Gallios フルデジタル型 40Mz 20ビット
FC500 ハイブリッド型 - 20ビット
XL ハイブリッド型 - 20ビット
他社アナライザーA フルデジタル型 10Mz 14ビット
他社アナライザーB フルデジタル型 10Mz 14ビット
他社セルソーター フルデジタル型 10Mz 14ビット
アナログ方式フローサイトメーター
機種名 形式 サンプリング周波数 デジタル変換分解能
他社アナライザーC アナログ - 10ビット