1.　細胞周期はＤＡＰＩ蛍光色素が使え、CV値が良いこと

核DNAを蛍光色素で染色し、その蛍光強度（DNA量）から細胞周期を求められます。細胞周期解析において、各期（Go/G1期, S期, G2/M期）を正確に求めるために、分解能の高い測定データが必要です。なぜならば、S期の一部がGo/Ｇ1期とＧ2/M期と重なるため、細胞周期解析専用プログラムを用いて、S期の割合を推量しなければなりません（図1．参照）。その際、G0/G1とG2/Mのピークが、分解能の高い、すなわちCV値の良い、鋭いピークの場合、解析誤差は最小化できます（図2．参照）。

図1．細胞周期測定データ （A：理想的なデータ、B：実際の測定データと各期）

図2．　細胞周期測定データ （A：CV値の良いデータ、B：CV値の悪いデータ）

そのためには、蛍光の分解能の高い（蛍光標準ビーズでのCV値が1%程度）フローサイトメーターが必要です。フローサイトメトリーでは、サンプルの流れを遅くし、サンプル流の幅を狭くすると、蛍光分解能は向上します。楕円光束を用いる機種は、Area（面積、積分）パルスを用いますが、検出したパルスを正確に積分する回路が重要です。なお、DNA蛍光の強度は大変強いので、蛍光感度は問題にはなりません さらに、DNA染色に使用する蛍光色素は、二重鎖DNA以外に反応しない蛍光色素が適しています。RNAやその他の物質に蛍光色素が反応すると、データの分解能が大幅に低下します。

現在、特異性の最も高い蛍光色素は、DAPIまたはHoechst33342とされています。さらに、これらは固定処理や裸核処理をしない生染色ができ、細胞の凝集も少なく、染色の手技も簡単です。しかし、UV光による励起が必要です。UVレーザーは、大型で高価なため（500万円以上）、UVレーザーを搭載したフローサイトメーターは、大型で高価（2,500万円以上）なものになります。
近年、高圧Hgアークランプを搭載した安価なフローサイトメーターが登場しました。

表1．細胞周期解析用の蛍光色素

蛍光色素	最大励起波長	最大蛍光波長	説明
Hoechst33342	343nm	483nm	A-T特異的DNA染色､生細胞DNA染色、UV励起
DAPI	345nm	455nm	A-T特異的DNA染色､生細胞DNA染色、UV励起
Chromomycin A3	442/457nm	575nm	G-C特異的DNA染色、440または45７nm励起
PI	305/536nm	617nm	細胞周期測定､死細胞検出、RNAにも染色
YOYO-1	491nm	509nm	細胞周期測定、死細胞検出、ＲＮＡにも染色
CPO	488nm	530/670nm	DNA染色(530)/RNA染色(670)､網赤血球測定
Pyronin Y	540nm	570nm	DNA染色(530)/RNA染色(670)､網赤血球測定

なお、BrdUを用いる方法（2カラー測定）は、S期を分離して測定することができますが、BrdUの取り込みや染色操作が煩雑です。

図3．BrdU法

DNA 複製期において thymidine の代わりに thymidine のアナログである 5-Bromo-2-deoxyuridine（BrdU）を取り込ませた細胞を抗 BrdU 抗体で検出する。