フローサイトメーターによる悪性リンパ腫の解析 -A to Z-

2.操作方法

【4】DNA量の測定(方法の選択はCVが良好なもの)

悪性リンパ腫においてFCMでの解析目的の第一は、腫瘍性増殖している細胞の有無を調べることであり、DNA量の測定によってaneuploid cellsを検出できれば、一目瞭然である。DNAの染色方法は、未固定の新鮮生細胞を用い、界面活性剤による裸核化細胞をpropidium iodideにて染色する方法が、一般的なFCMにおいて最も精度が高く簡便である。

1)PI染色法(簡便・低コストで貴重な情報を提供)

体腔液および新鮮な生検組織材料から得られた浮遊細胞を用いる.5×104~5×105個の細胞を遠心して沈渣にし,0.1mLの 0.1% TritonX100/PBS(-)を加え良く混和して裸核化する。その後0.1mLの0.1%RNase/PBS(-)を加えて、室温にて5分間処理した後、0.2mLの100μg/mL Propidium Iodideにて氷中15分間DNA染色を行う。PIは終濃度50μg/mLで蛍光強度がプラトーとなり、CVも良好である。

DNA量の測定におけるPI濃度

  • Propidium Iodideは、アルゴンイオンレーザー(488nm)搭載FCMにおけるDNA量測定に最も繁用されている蛍光色素である。蛍光は約550~700nmの幅広い蛍光を発するが、そのピークは620nmであり、ベックマン・コールターのFCMでは620nmのBand Pass filterを使用する。
  • 染色方法は、最も分解能の高い方法である新鮮生材料を界面活性剤にて裸核化し、その後にDNA染色するのが良い。
  • Propidium Iodideは、1mg/mL50%エタノール溶液を保存液として使用時希釈して用いる。保存液は冷蔵で数年安定である。使用濃度は、蛍光強度がほぼプラトーとなる50μg/mLを終濃度とする。ただし、FITC標識抗体との2重染色をする場合には、裸核化せず0.5%サポニン・0.75%ホルマリン液PBSで固定し、PIの終濃度を5μg/mLとして染色する。

2)PIとマーカーとの2重染色(まずはPIで単染色、必要に応じ2重染色)

DNA aneuploid cellを認めた時に、その細胞の系統や表面形質を明らかにしたい場合は、FITC標識の系統特異的もしくはサブセット抗体(CD2,3,4,8,19,20,13,36など)とPIとの2重染色が有効である。表面抗原を通常の方法で染色した後、その細胞沈差に2mLの冷固定液(0.75%ホルマリン・0.5%サポニン/PBS)を混和しながら添加して、氷中で5分間固定する。遠心にて上清を除去した細胞沈差に、5μg/mLのPI/PBS溶液を添加してDNA染色を染色する。PI/PBS溶液は、PI保存液を使用時PBSにて希釈して用いる。

DNAとマーカーの2重染色
DNAとマーカーの2重染色

なお、0.75%ホルマリン・0.5%サポニン/PBSの抗原の安定性は非常に高いが、各施設で使用する抗体の染色性については、事前に確認しておく必要がある。また、サイトグラムの変化についても、知っておく必要がある。

0.75%ホルマリン・0.5%サポニン固定と抗原の安定性
0.75%ホルマリン・0.5%サポニン固定と抗原の安定性

3)DNA量測定のための細胞保存(手軽で短期的な細胞保存が可能)

細胞沈渣に50~70%冷エタノールを混和しながら加え冷蔵保存しておくと、約6ヶ月は安定して測定できる。また、DNA遺伝子検査の検体としても利用可能であるため、余分な細胞やマーカー検査の測定後の細胞を回収し固定しておくことを勧める。