フローサイトメーターによる悪性リンパ腫の解析 -A to Z-

2．操作方法

【3】免疫染色（抗体クローンの選択と濃度検定は、Cytometristの仕事）

JCCLSから造血器腫瘍細胞表面抗原検査に関するガイドライン（JCCLS H2-P）が出されている。本ガイドラインは造血器腫瘍として白血病、悪性リンパ腫の表面抗原解析を中心に策定されたものであるが、マーカー検査の全体的な注意点などの指針を示すもので、抗体や蛍光物質の選択、さらに解析方法など具体的な記述はないため、Cytometristの力に大きく影響される。

1）免疫染色法（抗体濃度の基本は、10～500ng/test）

細胞数は2×106～1×107/mLで0.1mL使用するが、さらに少なくても解析は可能である。ただし、細胞数が多い場合は抗体量が不足するので、細胞濃度に注意する。一般に市販抗体は、1テスト当たりの使用液量が規定されているが、中には必要量以上の抗体を含んでいることがあるので、各施設で検定することを勧める。検定方法は末梢リンパ球などを対象に染色し、十分な蛍光強度が得られるか？その蛍光強度は2倍、4倍、8倍と希釈してどのくらい変化するのか？を注意して調べる。

PC5標識CD45抗体の希釈試験

PC5標識CD45抗体を希釈したリンパ球とデブリス領域の分解能
（対象は健常人末梢血）

抗体希釈によるヒストグラムの変化（陽性ピークはリンパ球）



抗体濃度の変化に伴うリンパ球の蛍光強度とS/N比
抗体
希釈率		 陰性（m.ch） 陽性（m.ch） S/N比
x1 0.746 59.8 80.2
x2 0.501 32.8 65.5
x4 0.463 17.4 37.6
x8 0.449 8.27 18.4

結果

  • 1．
  • 本抗体の染色性は高く，リンパ球とデブリス領域の分解能が十分であった．このことからCD45Blast Gateに使用可能であるが，反応液量および細胞量の極度の過剰状態では，染色性が下がるので注意が必要である．
  • 2．
  • 抗体の2n希釈により蛍光強度は約1/2ずつ低下したが，8倍希釈においてもデブリス領域との分解能は十分あった．このことから末梢血リンパ球を対象としたCD45 Gateでは，8倍希釈抗体の使用が可能と考えられた．

抗体希釈によるCD45 & SS ヒストグラムの変化

蛍光標識CD16抗体の検定

蛍光標識CD16抗体のメーカー，クローンおよび蛍光色素の違いによる染色性の比較
（健常人末梢血を無前処理である洗浄なしの全血法にて染色し，リンパ球を対象に解析）

各抗体の希釈に伴うヒストグラムの変化




各抗体の希釈に伴う陽性率と蛍光強度
CD16
抗体濃度		   A社
FITC		 B社
FITC		 C社
FITC		 C社
PE
x1 陽性率（%） 20.6 27.1 19.7 19.1
x2 % 19.7 23.8 18.2 17.0
x4 % 18.1 22.5 17.4 15.3
x1 蛍光強度(m.ch) 17.9 80.3 15.1 5.34
x2 m.ch 8.03 44.0 9.78 4.41
x4 m.ch 3.81 23.6 39.5 2.88

結果

  • 1．
  • FITC標識抗体（3社）の比較では，染色性が大きく異なり，4～5倍の差を認めた．
  • 2．
  • FITC標識とPE標識について，C社の同一クローンの抗体で比較すると， FITC標識抗体の方が蛍光強度が高値であった．一般にPE標識抗体の方が蛍光強度が高いとされるが，クローンによってはPE色素の標識が困難な場合があり，蛍光強度が低い製品があるので，一概に標識色素で検出感度を比較しない
  • 3．
  • 同一クローンのメーカー差について，FITC標識体A社とB社の抗体クローンは同一であり抗体濃度も同一である．しかし，染色性（蛍光強度）は大きく異なり約4倍の差を認めた．このように同一クローンであっても標識過程での抗原結合力の失活や，抗体濃度およびF/P比が同一であっても，標識抗体の回収分画に差があるなど，一概にクローン名で標識抗体の検出感度を比較しない．

2）1次スクリーニング（2重染色が安価で解析も容易である）

基本的には多重染色による解析が必要である。1次スクリーニングの例としてsIgκ/CD19、λ/19、γ/19、α/19、μ/19、δ/19、5/19、20/23、21/22、2/38、8/4、HLA-DR/3、45RA/4、45RO/3、7/10、16/56、30/3　の2重染色が挙げられる。なお、急性白血病で多用され「CD45 Blast ゲート」は、通常必要性はないが、ステージングの検査として骨髄を検査する際には、 CD45が弱陽性であれば浸潤の有無の解析に役立つため、予め腫瘍細胞の発現量の検索は有用である。また、腫瘍細胞が形質細胞様であれば、CD38強発現を確認し、「CD38 plasma ゲート」が有効である。ただし、骨髄血を対象にする場合には、CD38強陽性細胞が多いため、CD138が有用である。

CD45 Blast ゲート
CD45 Blast ゲート

MM/PCLの解析ゲート

なお、形質細胞を解析目的とする場合には、形質細胞は比重が重く、比重遠心法では単核球細胞分画として回収できないことがあるので注意が必要である。

3）追加検査

1次スクリーニングの結果、系統や病型を予想して、病型の診断や鑑別に必要となる追加マーカーを選択する。また解析方法も、症例毎に腫瘍細胞の割合や混在している細胞により、階層化ゲートやマーカーの組み合わせが変わるので、その点も十分考慮する必要がある。一般的な追加としては、解析目的細胞がT/NK細胞性で、未分化様であれば、CD1a、34、TdT、成熟細胞であればCD11b、25、57、71、122などを、B細胞性では、CLL/SLL様であればCD11c、25を、分化が進んだ形質細胞様であればCD138、cIg(κ、λ、γ、α、μ、δ)を追加する。時にはCD13、33などの骨髄系マーカーの検索も必要である。