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マウス末梢血 小核試験キット gTox Flow （研究用）
げっ歯類を用いるin vivo遺伝毒性試験では、一般的にマウスまたはラットに薬剤を投与し、その吸収、分布、代謝、排泄を加味した遺伝毒性活性を評価します。 げっ歯類を用いるin vivo遺伝毒性試験には、末梢血または骨髄細胞を用いる小核、および骨髄細胞の分裂中期像における染色体異常試験があります。 小核試験では、多染性赤血球中の小核を計測します。しかし、小核の頻度が少ない場合、適当な統計学的な感度が与えられるよう計測する細胞数を十分に大きくする必要があります。
gTox Flow遺伝毒性試験キットは、フローサイトメーターを用いて、目視法による計測 に比較し、統計学的に適当な感度となるマウス末梢血の多染性赤血球中の小核数を簡便・短時間に計測することができます。
- 高精度なデータ
- フローサイトメトリー法では、多染性赤血球を20,000個以上計測し、従来の目視法の2000個の計測に比べ、より精度の高いデータで小核を計測できます。
- サンプル調製は未洗浄・未固定
- gTox Flow遺伝毒性試験キットは、検体に調整済み試薬を添加するだけで簡単にサンプル調製ができ、すべての操作は室温で行い、固定や遠心操作などは必要ありません。 固定などの特別な操作がないので、サンプル調製のオートメーション化が可能です。
- 短時間
- gTox Flow遺伝毒性試験キットのサンプル調製は、試薬の添加だけで、1時間で完了します。フローサイトメーターでの結果解析までは、2時間未満で完了します。 また、FC500フローサイトメーターで測定する場合は、Microsoft EXCELで、バーコードでの検体管理と結果のマクロで簡単に結果を管理できます。
- 合理的な価格
- gTox Flow遺伝毒性試験キットは、1テスト当たり約2,700円と低コストです。
| 製品番号 | 製品名 | 容量 | 価格 |
|---|---|---|---|
| A49073 | マウス末梢血 小核試験キット gTox Flow | 60テスト | \160,000 |
| キット内容 |
|---|
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マウス小核試験キット gTox Flowリーフレット 
サンプル調製方法 （調製方法のビデオはこちらから）
| 1 | チューブに末梢血サンプル 10μL添加します |  |
|---|---|---|
| 2 | 希釈液 290μLと抗体 10μL添加します。 |  |
| 3 | 室温遮光30分放置します。 | |
| 4 | 希釈サンプル 20μL添加します。 |  |
| 5 | 膜透過処理液 400μL添加します。 |  |
| 6 | 室温遮光10分放置します。 | |
| 7 | RNaseA液 400μL添加します。 |  |
| 8 | 室温遮光15分放置します。 | |
| 9 | PI溶液 400μL添加します。 |  |
| 10 | 室温遮光5分放置します。 | |
| 11 | フローサイトメーターにて解析します。 |  |
解析方法
小核を有する多染性赤血球の出現頻度は、下記の式から求めます。
小核（％）＝小核を有する多染性赤血球細胞数/多染性赤血球細胞数×100
小核の出現頻度の計算はCytomics FC500 CXPソフトの場合、自動計算用のMicrosoft Excelのマクロをご利用いただけます。
相関、測定精度と感度
遺伝毒性を示す薬剤でマウスを処理したサンプルを、gTox Flowキットと、既存のフローサイトメトリー法で測定し、相関を調べました。gTox Flowは相関が>0.9と良い相関を示しました。
既存のフローサイトメトリー法とgTox Flowキットとの相関データ
CD-1マウスのVehicleの場合、多染性赤血球の中の小核の割合いは、約0.2％です。このとき、多染性赤血球を目視法と同じ2,000個計測した場合（小核を有する多染性赤血球数4個程度）のCV値は約50％、8,000個計測した場合（8個程度）のCV値は約25％、20,000個計測した場合（40個程度）のCV値は約１6%となります。正確で再現性のある精度の高い小核試験データを得るためには、より多くの多染性赤血球を計測する必要があります。
110匹の正常CD-1マウスのデータ分布です（緑色の棒グラフ）。統計的に、95%の実験における、p=0.01の信頼水準で、遺伝毒性の指標である多染性赤血球中の小核（MNPCE）のMNPCEの陽性閾値は、多染性赤血球の計測数で異なります。
・ 多染性赤血球を4,000個計測した場合の陽性閾値は0.70％です。
・ 多染性赤血球を20,000個計測した場合の陽性閾値は 0.54%です。
CD-1マウスに対して、4つの化合物で濃度と処理時間を変えて処理した結果です。 AからDの処理に関しては、遺伝毒性はgTox Flowでは検出されませんでした。処理の状態のGからRの処理に関しては、gTox Flowで明確に遺伝毒性が確認できます。GからRのような場合は、4,000の多染性赤血球（PCEs）で正確にデータを出すことができます。しかし、EとFのような場合（灰色部分）では、20,000個のPCEsを計測しなければ、遺伝毒性の有無が判定できません。
フローサイトメトリー法では、短時間で20,000個以上の多染性赤血球を計測することができ、正確な小核試験のデータを得ることができます。
データ例
CD-1マウス未処理
CD-1マウスを100 mg/kg MMS（methyl methane sulfonate）で24時間処理。
CD-1マウスを125 mg/kg vincristine sulfateで24時間処理。
- 参考文献
- 1. G.E. Kissling, et al., “Sensitivity of the erythrocyte micronucleus assay: dependence on number of cells scored and interanimal variability”, Mutat. Res.; Genet. Toxicol. Environ. Mutagen., 2007.
- 2. Norihide Asano, et al. ”Practical threshold for micronucleated reticulocyte induction observedfor low doses of mitomycin C, Ara-C and colchicine”, Mutagenesis vol. 21 no. 1 pp. 15?20, 2006
