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■ 細胞表面マーカーのサンプル調製と染色方法
　
　 III．直接免疫蛍光法 （ヒト全血） 　
　 　 　
　 2．Wash
サンプル処理　1〜5カラー解析（FITC／PE／ECD／PC5またはPE-Cy5／PC7）
　 （2）　全血ライジングキット　（Wash）
　
　
1. 準備
測定する患者検体ごとに試験管（12×75mm）を測定項目数＋1本用意し､1本にコントロール､残りに抗体名をラベルします｡ 		　
　
6. 溶血剤の添加＊3
イムノライズ希釈液＊3を各試験管に1mLずつ加え､よく攪拌します｡
　　　　　
　
2.抗体の添加＊1
抗体名をラベルした試験管に各抗体を規定量＊1加えます｡コントロールの試験管には､調べたい抗体に対応するアイソタイプコントロールを加えます｡ 		　
　
7. インキュベーション
室温（20〜25℃）で､30秒〜2分インキュベーションします（サンプルの濁りがなくなれば､溶血は完了です）｡
　　　　　
　
3. 検体の添加＊2
ヒト全血100μ（ミュー）L＊2を加え､Vortexでよく攪拌します｡		　
　
8. 固定剤の添加
キット添付のフィクサティブを250μ（ミュー）L加え､ Vortexでよく攪拌します｡
　　　　　
　
4. インキュベーション
室温（20〜25℃）､暗所で30〜45分インキュベーションします｡		　
　
9. 洗浄
PBSを2mL加え､ Vortexでよく攪拌します｡
400〜450×g､5分間遠心し､上清を除去します｡
もう1回､繰り返します｡
　　　　　
　
5. 血漿の除去
PBSを2mL加え､ よく攪拌します｡
500×g､5分間遠心し､上清を吸引除去します｡
もう1回､繰り返します｡ 		　
　
10. 測定
PBS 500μ（ミュー）Lに再浮遊後､測定まで2〜8℃で遮光保存し､ なるべく速やかにフローサイトメーターで測定してください｡
すぐに測定できない場合は､0.5％パラホルムアルデヒドPBS 500μ（ミュー）Lに再浮遊し､24時間以内に測定してください｡
　
＊1 1テストあたりの抗体規定量
COULTER CLONE：使用前に5μ（ミュー）Lに血清加 PBS195μ（ミュー）Lの割合で希釈し､200μ（ミュー）Lご使用ください｡
CYTO-STAT：10μ（ミュー）L
OptiClone： 20μ（ミュー）L
IOTest： 20μ（ミュー）Lまたは10μ（ミュー）L
　＊2白血球数が3〜10×103／mm3である検体を用いてください｡
検体の白血球数の調整は､『II.試薬･材料および検体』の(1)ヒト全血の項( 2．検体 )をご参照ください｡
　
＊3
イムノライズ 1容をPBS 24容で希釈します（25倍希釈､用時調製）｡
1 検体当たり希釈液1mL用います｡
　
　 　
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