3. 蛍光感度とログスケール

陰性ピークと弱陽性ピークとの間のキレの良さは、データ（陽性率などの統計値）に大きな影響を与えます。 現在のフローサイトメーターの最高蛍光感度は、FITC蛍光で100MESF、PE蛍光で50MESF程度です。各社ともその他の蛍光感度に関しては、公表せず不明です。一般的に、濃赤色から赤外領域では、検出器PMTの感度が低下します。また、光ファイバーは、UVから紫色領域で、光の吸収があります。

図5．蛍光ビーズと検量線

各種蛍光色素の強度の違いも注意しなければなりません。一般に、標識蛍光色素の違いによる抗体の蛍光強度は、下記の順に強くなるとされています （同一の抗体で、標識蛍光色素のみを変えて比較）。

PerCP　≦　FITC　＜　ECD　≦　APC　＜　PC7　≦　PC5　＜　PE

陰性ピークと弱陽性ピークのキレの良さは、フローサイトメーターの蛍光感度と、使用する蛍光色素に依存します。

もうひとつ大事なポイントがあります。免疫アプリケーションでは、蛍光パラメータはログスケール（対数目盛）を使用します。

図6．フローサイトメーター（アナログ方式）のデータ例

通常は、4桁の対数、1:10,000を用います。近年、デジタルフローサイトメーターが普及し、ログスケールの直線性、定量性は、改善されました(図7．右参照)。しかし、機種によっては、A/Dコンバーターの分解能不足で陰性ピークを正確に描けない、不正確なヒストグラムを出力する場合があります(図7. 参照)。そのような機種は、スムージング処理や推量補間などのデジタル処理で取り繕います。一方で、5桁　1：100,000の広い測定範囲（ダイナミックレンジ）を有する最新機種も登場しました（図10. 参照）。

図7．　14ビットデジタルフローサイトメーターのデータ例（ピークシグナル）
対数一桁目の量子化誤差が大きい


図8．14ビットデジタルフローサイトメーターのデータ例（ピークシグナル）
対数二桁目に陰性ピークを移動し、強陽性ピークがスケールアウト


図9．20ビットデジタルフローサイトメーターのデータ例
量子化誤差が皆無


図10．23ビットデジタルフローサイトメーターのデータ例
5桁の対数目盛

まとめ

3つのポイントは、互いに関連します。

1. マルチカラー測定と蛍光補正
2. 測定精度と検出感度
3. 蛍光感度とログスケール

免疫学の研究者の方々が、一番見過ごされているポイントは、マルチカラー測定と測定精度の関係だと思います。多重染色によるマルチカラー測定データの有用性は、その測定精度にかかっています。特に、存在比率の少ないポピュレーションは、測定精度を向上させるだけで、新たな知見が得られるかもしれません。できるだけ多くの細胞数を測定し、常に測定精度の高いデータを用いて考察することが、大切なことでしょう。