FCMの原理入門Ⅲ　フローサイトメトリーの概要　/サイトメトリー専門Webサイト

フローサイトメトリーは、サンプル中に存在する細胞や細菌などの特性を、光や蛍光色素などを利用して1個ずつ、
迅速かつ高感度に測定する方法です。蛍光を測定する標準的な方法の蛍光顕微鏡と比べて、次のような特徴があります。

短時間に多くの細胞数を客観的に測定できる。（高速性、正確性）
微弱な光でも測定できる。（高感度、定量性）
同一条件での測定が可能である。（高再現性）
1回の測定で多くの情報（マルチパラメータ）を取得できる。
目的の細胞集団によるクラスター分析が可能である。
特定の細胞の高速分取（ソーティング）ができる。

フローサイトメーターは、機能的な特徴から大きく4つの製品群に分けられます。

セルソーター（自動細胞解析分取装置）

研究に合わせたレーザーの増設など機能の拡張性を持ち、同時に2種類または4種類の目的細胞集団の高速分取が可能です。細胞分取速度の違いにより、高速タイプと超高速タイプに分けられます。拡張機能として、マイクロタイタープレートの各ウエルに分取することも可能です。

EPICS ALTRA HyPerSortシリーズ
MoFlo
FACSAria

セルアナライザー（自動細胞解析装置）

細胞の分取機能を持たない解析専用で、拡張性もやや乏しいが、小型の空冷レーザーを搭載し、コンパクトで簡便な操作でサンプル測定が可能です。オートサンプラを内蔵した機種は、すべて自動での測定解析が可能となりました。最新機種は、高精度自動蛍光補正に対応しています。

EPICS XL、XL／MCL
Cytomics FC500
FACSCalibur
FACSCanto

高分解能型セルアナライザー

前方散乱光を使用せず、電気抵抗法（コールター原理）で精密な細胞体積と、蛍光を定量分析するフローサイトメーターです。水銀アークランプによるUV光が励起光として使え、ローコストも特長です。アポトーシス解析や細胞周期解析、生死数測定に適しています。

Cell Lab Quanta SC

高速型セルアナライザー

希少細胞やMRDなどの含有率の低い測定（1％～0.0001％程度）や陽性率の低いマルチカラー測定では、100万個以上の測定が必要です。高速型フローサイトメーターは1秒間に5万個以上のスピードで測定可能です。1,000万個の細胞を3分足らずで測定できる高精度な測定が可能です。

CyAn ADP

※ FACSはBecton Dickinson社の商標です。

フローサイトメーターで測定可能なサンプルは、1個づつの状態の細胞や粒子などの浮遊液であることが必要です。この条件を満たしていれば、通常のシステムの場合、個々の大きさが 40μm(※1)位までの範囲であれば、様々なものが測定可能です。

血球細胞（白血球、赤血球、血小板など）
動物細胞（培養細胞、単離組織など）
植物細胞
微生物（細菌、原虫など）
海洋生物（プランクトンなど）
精子、酵母など
ラテックスビーズ（マルチプレックスによるサイトカイン定量解析など）

この章では、血球および動物細胞を念頭にご説明します。
サンプルは、細胞浮遊液（液中に細胞が1個ずつ分離・浮遊しているもの）を用います。
凝集塊は、細胞が通過するフローセルを詰まらせる原因になります。

※1
測定可能な細胞径（直径）は約0.3μmから40μmです。蛍光のみの測定ならば、分子レベルのものから直径40μmまで
の粒子の測定が可能です。フローセルノズルを交換できる機種は、最大200μm程度のサンプルまで測定できます。
一般的に、解析に最適な細胞濃度は1×10⁶～5×10⁶個/mLです。

散乱とは、レーザー光が細胞などの微小な粒子に当たって、すべての方向にレーザー光と同じ波長の光を発する現象です。
その強さは、細胞や粒子の大きさとその散乱方向に依存します。

前方散乱光：FS

レーザー光の軸に対して前方向の小さい角度（例　1.5°～19°）で散乱する光を前方散乱光またはFS（Forward Scatter）と呼びます。FSは細胞表面で生じるレーザー光の散乱光や回折光、屈折光からなります。サンプルの大きさに関する情報が得られます。細胞表面の状態、核の形状や有無、細胞の形、その通過方向など多くの要因に影響されます。細胞容積を電気抵抗法で測定する高分解能型フローサイトメトリーが最近開発され、精密に細胞一個ごとの容積と蛍光を定量分析することが可能になりました。

側方散乱光：SS

レーザー光の軸に対して約90°の角度で散乱する光を側方散乱光またはSS（Side Scatter）と呼びます。SSは細胞内顆粒や核等で生じるレーザー光の散乱光で、細胞の内部構造に関連します。前方散乱光と比べて、はるかに微弱な光です。

蛍光色素がレーザー光により励起され、そのエネルギーの一部を吸収し、残りのエネルギーを発光します。この光を蛍光またはFL（Fluorescence）と呼びます。蛍光は、レーザー光よりも長い波長の光です。使用する蛍光色素により蛍光波長が異なり、細胞の様々な情報を示します。たとえば、モノクローナル抗体に結合したFITCと呼ばれる蛍光色素は、488nmのレーザー光で励起され、525nm付近の緑色の蛍光を発します。この蛍光の強度は、細胞における特定の抗原の量を示します。また、PI（Propidium Iodide）という蛍光色素は、細胞中のDNAに結合し、488nmの光で励起され、主に610nm付近の赤い蛍光を発します。この蛍光量（蛍光強度）はDNA含量（核の総DNA量）を示します

フローサイトメーターで測定可能なパラメータは、次のようなパラメータです。これらのパラメータは解析と分取の両方で使用可能です。各パラメータには、リニアスケールとログスケールのパラメータがあります。

前方散乱光（Forward Scatter、FS）＝細胞の大きさの目安
側方散乱光（Side Scatter、SS）＝細胞内部の複雑さ
蛍光（Fluorescence、FL）
細胞容積（Cell Volume CV）高分解能型セルアナライザーのみ可能
RATIO（比率）＝2つのパラメータの比率　例：蛍光1/蛍光2、蛍光/細胞容積
TIME（時間）＝測定時間（経時変化）

一般的な蛍光色素の例を示します。（488nm励起）

緑色	FITC､TO､Fluo-3､ GFPなど
オレンジ色	Phycoerythrin､PEなど
赤色	ECD､PIなど
濃赤色	PC5､7AADなど
黒赤色	PC7など

蛍光強度により細胞表面抗原や､DNA量､RNA量などが測定できます。

これらのパラメータは、目的に応じて、選択されます。通常、フローサイトメーターは、これらのパラメータの中から、同時に8個から16個のパラメータを取得して解析・分取することが可能です。

※ 代表的なアプリケーション例を表1に示します。

アプリケーションは、使用する測定パラメータと蛍光色素とサンプルで決定されます。様々なサンプル調製方法、染色法があります。

代表的なアプリケーション例を表1に示します。

表1：アプリケーション例

アプリケーション	サンプル	サンプル調製（詳細は試薬添付の説明書をお読みください）	計測対象	使用パラメータ
細胞表面抗原（細胞内抗原）陽性率、抗原量、抗原密度	全血バフィーコート単核細胞分離組織血小板	TQ-Prep 全血ライジングキット Ficol（IntraPrep）抗体詳しくはこちら	細胞の大きさと構造 FITC、PE、PC5や深紅色の蛍光	前方散乱光（FS）または細胞容積側方散乱光（SS） Log FL（ログ蛍光）
核酸（細胞周期）（アポトーシス）	全血分離組織凍結切片パラフィン包埋切片生体液	各種染色法 DAPI ヨウ化プロピジウム（PI）などの蛍光色素	細胞の大きさと構造緑、赤、橙色の蛍光	前方散乱光（FS）または細胞容積側方散乱光（SS） FL（蛍光）
カイネティクス (細胞内イオン濃度)	全血バフィーコート単核細胞組織培養細胞	各種方法 Indo-1、SBIF Fluo-3などの蛍光色素	細胞の大きさと構造蛍光比率時間	前方散乱光（FS）または細胞容積側方散乱光（SS） FL、Log FL Ratio Time
細胞機能	全血バフィーコート単核細胞組織培養細胞	各種方法 DCFH-DA DiO-3 FDA、アネキシンⅤ GFPなどの蛍光色素	細胞の大きさと構造蛍光	前方散乱光（FS）または細胞容積 FL 側方散乱光（SS）
可溶成分（フロービーズアレイ）	ビーズ	各種方法 PE、濃赤色（ビーズ）	ビーズの大きさ蛍光	前方散乱光（FS）またはビーズ容積 Log FL

フローサイトメーター（セルアナライザーの場合）の一般的な測定手順を紹介します。

フローサイトメーターの電源をONにします。レーザーも自動的にONになります。自動スタートアップ＆洗浄サイクルが開始されます。
10分から15分後、ディスプレイにReadyが表示されます。
精度管理を行います。
まず、機器の分解能と感度を、標準粒子を用いてCheckします。その結果と機器設定値を記録します（X-R管理図に自動プロットされる機種もあります）。

分解能用標準粒子（蛍光とサイズが均一なラテックスビーズ）で、蛍光と前方散乱光のCV値をCheck
感度用標準粒子（蛍光強度がFITCやPEの一般的な免疫蛍光強度に近く、大きさもリンパ球に近いラテックスビーズ）で、蛍光強度のピーク位置をCheck

コントロールサンプル（標準培養細胞や標準血球など）がある場合は、試薬やプロセスをCheckするために、これをサンプル調製し、測定します。その結果を記録します。（X-R管理図に自動プロットされる機種もあります）
サンプル測定を行います。多くのフローサイトメーターは、測定条件や解析条件をプロトコルファイルとして記憶していますので、これを呼び出し、測定を開始します。
必要ならば、感度調整、ゲートエリア調整、蛍光補正を行います（これらをすべて自動で行う機種もあります）。
オートサンプラーを内蔵し完全自動プログラムも搭載したフローサイトメーターは、サンプルをセットしたら、終了するまで、測定者は他の仕事をすることができます。洗浄や攪拌操作を含めて、1サンプルを約40秒から1分ぐらいで自動測定し解析します。すべてのデータはディスクに自動記憶され、必要ならば解析結果を自動印字できます。EXCELにエクスポートしたり、ネットワークで転送することも可能です。
すべての測定が終了したら、印字された解析結果またはディスプレイのデータを確認します。
必要ならば、リストモードデータを用いて、再解析を行います。
終了したら、洗浄剤入りのサンプルチューブをセットします。
Shut　Downボタンを押します。